雙光子熒光成像(Two-Photon Fluorescence Imaging)
雙光子熒光顯微鏡(TPM)是激光掃描顯微鏡,局部激發(fā)基于雙光子吸收的熒光團(tuán)。目前,TPM以其優(yōu)異的穿透性和光學(xué)切片能力,成為活體完整組織或活體動物亞細(xì)胞分辨率下無創(chuàng)觀察細(xì)胞和器官結(jié)構(gòu)和功能活動的有力工具。
TPM已經(jīng)在各種應(yīng)用中得到了應(yīng)用。神經(jīng)科醫(yī)生使用TPM來監(jiān)測突觸、軸突、樹突、棘、神經(jīng)活動和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在不同的刺激下,如觸覺、食物、電和視覺模式,動物的反應(yīng)行為伴隨著功能性神經(jīng)尖峰和結(jié)構(gòu)變化[1-5]。因此,特定的行為與特定的神經(jīng)反應(yīng)有關(guān)。這些聯(lián)系提供了重要的信息,可能表明神經(jīng)系統(tǒng)如何處理來自外部世界的信息,并激活來自單個神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部的命令。TPM作為神經(jīng)科學(xué)的一種工具,發(fā)揮著極其重要的作用。此外,采用TPM觀察免疫效果。
1.雙光子吸收和雙光子顯微鏡
1929年,在哥廷根理論物理研究所,Maria G?ppert-Mayer研究了兩個光子同時被一個分子吸收的量子可能性[15]。然而,雙光子吸收的可能性極低,需要極高的峰值光強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)演示。直到1961年,Kaiser和Garrett在1960年5月Maiman發(fā)明激光后不久,才在實(shí)驗(yàn)中首次實(shí)現(xiàn)了雙光子吸收[16]。1990年,Denk和Strickler和Webb將雙光子吸收與激光掃描共聚焦熒光顯微鏡相結(jié)合,具有前所未有的能力[17]。從那時起,配備了皮秒或飛秒脈沖、高功率激光器的雙光子顯微鏡已經(jīng)成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域三維高對比度、高分辨率、快速成像的標(biāo)準(zhǔn)工具。
圖1.雙光子激發(fā)和雙光子顯微鏡。(a)單光子激發(fā)示意圖和雙光子激發(fā)。(b)雙光子顯微鏡系統(tǒng)。(c) (a)單光子圖像熒光和雙光子熒光。(來源于文獻(xiàn)[18])
如圖1.a所示,一個熒光團(tuán)分子被一個光子激發(fā)到一個高能狀態(tài)。在這種狀態(tài)下停留很短的時間后,通過非輻射弛豫,熒光團(tuán)轉(zhuǎn)移到基態(tài),并在納秒內(nèi)發(fā)射熒光光子。由于弛豫能的損失,激發(fā)光子的能量大于發(fā)射光子;換句話說,激發(fā)光的波長比發(fā)射光的波長短。對于單光子激發(fā),發(fā)射熒光的強(qiáng)度與激發(fā)激光的強(qiáng)度成線性正比。
如果一個光子的能量不足以將熒光團(tuán)激發(fā)到激發(fā)態(tài),則不會發(fā)生激發(fā)和發(fā)射。然而,如果兩個光子的能量足夠,則可能發(fā)生激發(fā)。為了更容易理解,我們可以假設(shè)一個功率不足的光子將熒光團(tuán)推到持續(xù)很短時間的虛狀態(tài)。在此期間,如果該虛態(tài)熒光團(tuán)遇到另一個功率不足的光子,并且這兩個光子的能量足以激發(fā),則可能發(fā)生激發(fā),如圖1.a所示。對于雙光子激發(fā),發(fā)射熒光的強(qiáng)度與激發(fā)激光強(qiáng)度的平方成正比。不同分子的雙光子激發(fā)概率用橫截面表示,單位為GM (G?ppert-Mayer)或10 x 50 cm4 s/光子。例如,EGFP (Clontech)在927 nm波長下的雙光子激發(fā)截面約等于39 x 10 x 50 cm4 s/光子。由于這種極低的概率,雙光子吸收是罕見的,很難觀察到。為了提高雙光子吸收,一種方法是使用具有更高雙光子橫截面和適當(dāng)波長的明亮標(biāo)記進(jìn)行照明。另一種方法是在空間和時間上聚焦激光,形成更密集的光子通量。實(shí)際上,高na(數(shù)值孔徑)物鏡用于緊聚焦激光,以在空間上增加光子密度。同時,脈沖激光被用來暫時增加光子的密度。
一個典型的雙光子顯微鏡系統(tǒng)如圖1.b所示,由Ti:藍(lán)寶石激光器、galgal反光鏡、物鏡和光電倍增管(PMT)組成。脈沖激光光斑被樣品平面上的反射鏡掃描,熒光被收集,然后由于其靈敏度投射到PMT上。然后,將PMT記錄的信號重新組織成時間序列,形成圖像。例如,由于其穩(wěn)定性和靈活性,將重復(fù)頻率為80 MHz,脈沖持續(xù)時間為~100 fs,平均功率為50 mW的鎖模Ti:藍(lán)寶石激光器用于雙光子顯微鏡,該激光器由532 nm的激光器泵浦,產(chǎn)生700-1300 nm的脈沖激光。掃描儀,通常是一個兩軸galvom鏡或聲光偏轉(zhuǎn)器(AOD),將激光光斑重定向到標(biāo)本平面上的不同橫向位置。對于體成像,需要軸向掃描機(jī)制,通常使用壓電、電可調(diào)透鏡(ETL)、空間光調(diào)制器(SLM)、可調(diào)聲學(xué)梯度折射率透鏡(TAG)或遠(yuǎn)程聚焦。有不同的掃描策略,如逐行掃描或逐目標(biāo)掃描。最常用的逐行掃描以有限的成像速度產(chǎn)生足夠的采樣。高速逐目標(biāo)成像僅掃描先前對大腦區(qū)域掃描確定的一些固定位置,以定位單個神經(jīng)元[19]。
由于雙光子熒光的稀缺性,雙光子顯微鏡中的檢測器必須具有很高的靈敏度。pmt和雪崩光電二極管(apd)在低光子探測中得到了廣泛的應(yīng)用。PMT使用多個外部放大器,以近1ns的短響應(yīng)時間將一個電子提升到數(shù)百萬個。TPM的一個優(yōu)點(diǎn)是光學(xué)切片能力。如上所示,雙光子吸收是困難的,只有靠近激光焦點(diǎn)的區(qū)域才有足夠的光子進(jìn)行有效的雙光子激發(fā),因此收集到的熒光只來自于如圖1.c所示的焦點(diǎn)區(qū)域。因此,在遠(yuǎn)離焦點(diǎn)的區(qū)域沒有足夠的TPM激發(fā),從而導(dǎo)致較少的光漂白和光毒性。這種光學(xué)切片能力非常類似于在單光子共聚焦顯微鏡,但源于雙光子激發(fā)沒有針孔。TPM具有光學(xué)切片能力,在一般情況下提供高信噪比的圖像,對比度令人滿意。
TPM的另一個優(yōu)點(diǎn)是它對樣品的滲透深度長。事實(shí)上,不均勻的生物組織散射光,導(dǎo)致退化的約束激發(fā)光子密度和成像對比度。在散射中占主導(dǎo)地位的瑞利散射與波長成反比,TPM中使用的紅外光的波長比傳統(tǒng)的單光子顯微鏡(如共聚焦顯微鏡)中使用的可見光的波長長。此外,與單光子成像相比,雙光子成像中波長較長的激發(fā)光被生物組織的主要成分水吸收較少。這兩大特性使得TPM中的紅外光激發(fā)更深。這種特性對于需要深穿透深度的應(yīng)用至關(guān)重要。
因此,TPM特別適用于活體和原位深部埋深、分布較厚的組織的成像目標(biāo),如皮層下神經(jīng)元的成像。此外,由于光效率的關(guān)系,光漂白和光毒性不是光子預(yù)算的主要考慮因素。但是,應(yīng)考慮線性吸收引起的熱損傷。據(jù)報道,平均功率的安全限制為2-5 mW/μm2,脈沖能量密度的安全限制為0.025-0.06 nJ/μm2。
圖2.基于TPM的ao輔助共聚焦和TPM。(a)的雙色共聚焦成像少突膠質(zhì)細(xì)胞(洋紅色)和神經(jīng)元核(綠色)(來源于參考文獻(xiàn)23)。(b) TPM三維圖像堆棧和不同深度的圖像來自于體積為810μm3的體內(nèi)神經(jīng)元成像vS1皮質(zhì)與系統(tǒng)AO和完全AO校正。(來源于參考文獻(xiàn)26)
在神經(jīng)科學(xué)中,視覺刺激,例如旋轉(zhuǎn)光柵圖案,虛擬現(xiàn)實(shí)場景或LED信號,對于發(fā)現(xiàn)行為與神經(jīng)元反應(yīng)之間的聯(lián)系和關(guān)系至關(guān)重要。然而,包括斑馬魚在內(nèi)的大多數(shù)動物在單光子顯微鏡下都能看到光源,這就提出了一個問題,即神經(jīng)元是對視覺刺激模式做出反應(yīng),還是僅僅對單光子激光激發(fā)源做出反應(yīng)。相比之下,在雙光子顯微鏡下,紅外光源是不可見的,這就排除了光源干涉的可能性。
由于存在不均勻的折射率和組織散射,激發(fā)光經(jīng)常發(fā)生畸變,難以有效聚焦。扭曲的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)(PSF)降低了光子強(qiáng)度,導(dǎo)致信號急劇下降,直到信號在一定深度完全淹沒在噪聲中。自適應(yīng)光學(xué)(AO)系統(tǒng)通常用于處理這種情況。在檢索或重建樣品誘導(dǎo)的波前后,通過使用有源光學(xué)元件(如空間光調(diào)制器或可變形鏡)在系統(tǒng)中施加補(bǔ)償波前來抵消攝動[22-25]。此外,雙光子激發(fā)熒光還可以作為另一種成像模型的指導(dǎo),如圖2.a, b所示。2018年,Janelia Research Campus的Betzig小組[26]報道了一種結(jié)合點(diǎn)陣光片和基于tpm的AO的系統(tǒng)。將TPM的熒光發(fā)送到Shack-Hartmann波前傳感器重建局部區(qū)域的波前,并對激發(fā)和發(fā)射路徑進(jìn)行補(bǔ)償,充分挖掘晶格光片的功率。
圖3.空間和時間聚焦和復(fù)雜。(a)基于雕刻PSF技術(shù)的時間聚焦示意圖,激光束撞擊光柵、物鏡的后焦平面和焦平面的時空截面剖面圖。(b)使用微透鏡陣列的多焦點(diǎn)空間復(fù)合。(c)多脈沖時間復(fù)合。(d)基于衍射受限psf的采樣和基于雕刻psf的采樣的比較。(來源于參考文獻(xiàn)28)
2. 圖像采集速度
掃描顯微鏡的一個主要缺點(diǎn)是成像速度的限制。通過使用掃描裝置,例如galgal鏡,激光焦點(diǎn)在整個視場中逐點(diǎn)移動感興趣區(qū)域(ROI)。為了獲得可接受的熒光強(qiáng)度,探測器的積分時間應(yīng)該足夠長,以接收多個熒光光子。通常,當(dāng)使用重復(fù)頻率為80 MHz的激光源時,TPM產(chǎn)生12 MHz的有效像素率;換句話說,幾乎5-6個脈沖的熒光產(chǎn)生一個像素。
近幾十年來,已經(jīng)開發(fā)了許多技術(shù)來解決這個問題。2005年,康奈爾大學(xué)的Chris Xu小組[27]報道了空間和時間聚焦(TeFo)技術(shù),以減少背景以獲得更好的穿透。一個光學(xué)光柵被用來形成“彩虹”光束,平行光束按波長線性位移。每個光譜分量都是空間聚焦的,但不是很好地重疊,這增加了光子的軸向限制。TeFo提供了一個示例來說明如何在空間和時間上調(diào)制PSF。
基于TeFo, 2016年洛克菲勒大學(xué)的Vaziri小組[28]通過雕刻PSF技術(shù)演示了單脈沖每體素激發(fā)(圖3. d),以單細(xì)胞分辨率實(shí)現(xiàn)了快速體積速率和大體積(3-6 Hz, 0.5 x 0.5 x 0.5 mm3)。利用TeFo(雕刻型PSF ~5 x 5 x 10μm3,高斯型PSF ~5 x 5 x 70μm3)對PSF進(jìn)行軸向約束和側(cè)向擴(kuò)展,以激發(fā)最小體素并解析目標(biāo),如圖3.3a所示。注意,在這種情況下,激光的重復(fù)頻率相對較低(4.1 MHz),以增加一個脈沖中的光子通量。通過稍微降低空間分辨率,雕刻的PSF為快速、大體積成像提供了一個概念框架。
1998年,Stefan Hell小組[29]繪制了第一張用于多光子顯微鏡的空間復(fù)用示意圖。如圖3.b所示,利用旋轉(zhuǎn)的微透鏡盤對激光進(jìn)行空間分離,形成多焦激勵,使成像速度提高40 - 100倍。然而,單個焦點(diǎn)的能量急劇下降,這對信噪比和穿透都是有害的。2007年,W. Amir等人[30]提出了一種時間多重多光子顯微鏡。兩個激光源由兩個相互放置的脈沖序列組成,這些脈沖序列指向樣品的不同平面,通過對記錄的信號進(jìn)行解復(fù)用得到實(shí)際分布。這種方法提供了脈沖可以重新排序和分離的概念(圖3.c)。Vaziri團(tuán)隊(duì)在2019年通過結(jié)合時空復(fù)用、PSF雕刻和遠(yuǎn)程掃描技術(shù)達(dá)到了一個里程碑[31]。一方面,利用光柵對光按波長進(jìn)行故意分散,形成軸向受限、橫向擴(kuò)展的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù);然后,通過減少橫向采樣來提高成像速度。成功實(shí)現(xiàn)PSF雕刻的關(guān)鍵是使用低重復(fù)率激光和PSF軸向限制,以確保足夠的光子強(qiáng)度。另一方面,將脈沖分成多個光路以獲得不同的時間延遲,然后通過定制的鏡子沿不同的空間方向定向。時空復(fù)用為特定的成像需求提供了靈活的配置。通過結(jié)合雙光子/三光子顯微鏡中的PSF雕刻和時空復(fù)用,這種混合策略(HyMS)構(gòu)建了一個集成的概念框架,以適應(yīng)單細(xì)胞分辨率的高速(16.7 Hz, 0.69 x 0.675 x 0.6 mm3,TPM)和大容量(5.1 Hz, 1 x 1 x 0.6 mm3,TPM)成像采集的需求。在這種情況下,空間分辨率為更高的成像速度和更大的體積尺度而受到損害,但仍然足以解決單個神經(jīng)元。HyMS的像素采集速度接近PMT極限,像素在ROI內(nèi)分布規(guī)律。神經(jīng)元在大腦皮層中只占據(jù)很小的空間,一些采樣像素不提供神經(jīng)元信號。因此,在神經(jīng)科學(xué)中發(fā)展了獨(dú)特的技術(shù)。通常,三維隨機(jī)存取多光子熒光顯微鏡(RAMP)[32]充分利用了先前的生物學(xué)知識。RAMP使用激光聚焦光柵掃描一個神經(jīng)元,然后將激光焦點(diǎn)重定向到另一個神經(jīng)元進(jìn)行掃描,如圖4.a所示。隨后,在2019年,Chris Xu小組提出了一種自適應(yīng)激發(fā)源(AES),該激發(fā)源可以使激光焦點(diǎn)在空白區(qū)域被抑制,并在神經(jīng)元區(qū)域出現(xiàn)[19],如圖4.b所示。利用之前的全柵格掃描測量得到神經(jīng)元的占用區(qū)域及其ROI信息。與常規(guī)方案相比,激光阻斷策略大大降低了平均功率,這對于減少熱損傷的縱向神經(jīng)成像至關(guān)重要。具體來說,每個神經(jīng)元的平均光子數(shù)高出7倍,而平均功率幾乎降低了4.5倍(30 Hz, 0.7 x 0.7 mm2, 18 mW, TPM)。RAMP與AES的結(jié)合可進(jìn)一步提高成像速度和效率。
圖4.條件必選快速TPM。(a)三維隨機(jī)存取多光子自定義掃描光子顯微鏡(來源于參考文獻(xiàn)1)。(b)清醒小鼠硬腦膜下750μm神經(jīng)元結(jié)構(gòu)圖像的TPM比較(無自適應(yīng)激勵源和有自適應(yīng)激勵源時相同位置的TPM)。比例尺,100μm(來源于參考文獻(xiàn)19)。(c)清醒小鼠具有突觸分辨率的體積功能成像神經(jīng)元中高斯和貝塞爾模塊的最大強(qiáng)度投影(來源于參考文獻(xiàn)33)。(d) faces將脈沖光片重塑為空間分離和時間延遲的焦點(diǎn)x和z方向分辨率略有降低的物鏡焦平面(來源于參考文獻(xiàn)34)。(e)不同成像采集速度和視場的TPM成像參數(shù)優(yōu)化示例。(來源于參考文獻(xiàn)35)
最近,香港大學(xué)的Tsia小組和加州大學(xué)伯克利分校的Ji小組共同努力,報道了前所未有的超快TPM[34]。一個由一對幾乎平行的鏡子組成的模塊,稱為自由空間角啁啾增強(qiáng)延遲(faces),用于將一個光脈沖分成80個脈沖,這些脈沖在時間和空間上分離,從而實(shí)現(xiàn)水平圖像采樣,如圖4.d所示。然后,使用另一個galvom反鏡進(jìn)行垂直采樣,這意味著該galvom反鏡的速度決定了圖像采集速度。使用FACED-TPM,神經(jīng)元成像已觀察到高達(dá)3000 Hz (80 x 1200像素,50 x 250μm2),這足以監(jiān)測一些瞬態(tài)活動。在這種情況下,像素采集率達(dá)到了PMT硬件的限制。
對于大體積成像,例如中尺度成像,成像速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于要求。最近,Ji組將貝塞爾光束模塊和介觀鏡結(jié)合起來進(jìn)行稀疏標(biāo)記神經(jīng)元成像,避免了軸向掃描,速度提高了幾十倍[33],如圖4.c所示。貝塞爾光束模塊將高斯焦點(diǎn)重塑為貝塞爾焦點(diǎn),并具有細(xì)長的軸向分布。與高斯聚焦掃描策略(0.06 Hz, 307幅圖像,301x 405 x 612μm3)不同,貝塞爾焦點(diǎn)橫向掃描(3.2 Hz, 6幅圖像,301 x 405 x 612μm3)的熒光提供了軸向延伸的信息,而不需要實(shí)際的物理軸向掃描。貝塞爾光束的核心比高斯光束的核心小,橫向分辨率優(yōu)于高斯光束。由于貝塞爾光束軸向延長,光子密度降低,圖像信背景比(SNR)降低,穿透深度可能成為一個問題。
3. 采集的視野體積
由于采用TPM的掃描形式,可以實(shí)現(xiàn)體積視場和成像速度很容易相互交換不同的掃描模式。如從圖4.e可以看出,大視場掃描時,激光聚焦的移動需要更多的時間。演示了針對不同應(yīng)用優(yōu)化參數(shù)的TPM卡雷爾·斯沃博達(dá)在珍妮利亞研究校園報道。例如,用TPM映像1024 x 1024像素,面積0.6 x 0.6 mm2,像素大小0.6 x 0.6μm2幀率為21,而成像由七個條紋組成,每個條紋有1750 x 1750像素,4.4 x 4.2 mm2面積,2.4 x 2.6μm2像素尺寸幀率為1.9[35]。對于成像堆棧,TPM具有752 x 1125 x 307像素,a0.301 x 0.45 x 0.612 mm3的面積,而一個0.4 x 0.4 x 2μm3的像素大小將只有一個幀率為0.06[33]。
4. 采集的深度
如上所述,TPM具有良好的深度滲透性。一般用于小鼠腦成像的TPM深度約為0.6-0.7 mm,信噪比較好[19,31,33]。配備AO系統(tǒng)的先進(jìn)TPM實(shí)現(xiàn)了近衍射限制。如圖2.c所示[25]。Masashi Kondo等[36]在TPM中使用波長較長的激光源紅色指示器,對1.2 mm以內(nèi)的前額皮質(zhì)和海馬進(jìn)行功能性成像,其散射和吸收較少。更長的穿透(1.2 mm)與綠色指示將需要波長更長的三光子激發(fā)[31,37]。
5.結(jié)論及未來展望
(1)根據(jù)不同的生物學(xué)應(yīng)用,雙光子顯微鏡的空間、時間、成像深度和視場分別有不同的發(fā)展方向。
(2)微型雙光子顯微鏡提出了實(shí)現(xiàn)自由行為動物的高分辨率成像的最新前沿。
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END
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